[實(shí)驗(yàn)原理]
大腸桿菌是含有長(zhǎng)約3000Kb的環(huán)狀染色體的棒狀細(xì)菌,它能在僅含碳水化合物(如葡萄糖,提供碳源和能量)和提供氮、磷、微量元素的無(wú)機(jī)鹽的極限培養(yǎng)基上快速生長(zhǎng)。如果用含氨基酸、核苷酸前體、維生素以及其它一些細(xì)菌不能合成的代謝成分的豐富培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng),那么大腸桿菌會(huì)生長(zhǎng)的更快。大多數(shù)應(yīng)用于DNA重組技術(shù)的細(xì)菌是大腸桿菌K-12株的衍生菌株。
當(dāng)大腸桿菌在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí),其開(kāi)始裂殖前,先進(jìn)入一個(gè)生長(zhǎng)滯后期。在豐富培養(yǎng)基中,它能在20-30min內(nèi)復(fù)制一代,這種指數(shù)生長(zhǎng)相稱之為對(duì)數(shù)期。zui后,當(dāng)培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分和氧耗盡或當(dāng)培養(yǎng)基中廢物的含量達(dá)到抑制細(xì)菌的快速生長(zhǎng)的濃度時(shí),菌體密度就達(dá)到一個(gè)比較恒定的值。在通常的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)中,在這一時(shí)期的細(xì)胞密度一般為1*109—2*109ml,細(xì)胞停止迅速分裂。這就是細(xì)菌生長(zhǎng)的飽和期,而所謂的新鮮飽和即指當(dāng)培養(yǎng)液中細(xì)胞密度剛到達(dá)這一水平。
培養(yǎng)特征是指微生物在培養(yǎng)基上所表現(xiàn)的群體形態(tài)和生長(zhǎng)情況。細(xì)菌培養(yǎng)特征的常規(guī)檢驗(yàn)包括平面上的菌落特征,液體培養(yǎng)時(shí)的生長(zhǎng)特征以及斜面培養(yǎng)上的菌苔特征。菌落是個(gè)體微生物在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖成的肉眼可見(jiàn)的群落。在一定的培養(yǎng)條件下,不同的細(xì)菌形成的菌落形狀是不一樣的。
[儀器、材料與試劑]
(一) 儀器和材料
超凈工作臺(tái)酒精燈 無(wú)菌培養(yǎng)皿及試管 接種環(huán) 無(wú)菌牙簽 涂布棒DH5α菌株
(二) 試劑
LB液體培養(yǎng)基:每升含10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g NaCL、1mL 1M NaOH
LB固體培養(yǎng)基:每升含10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g NaCL、1mL 1M NaOH、15g瓊脂糖
[實(shí)驗(yàn)步驟]
(一) 在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)
將已熔化的LB固體培養(yǎng)基冷涼到50℃左右(即熱而不燙手),按無(wú)菌操作倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi),冷卻凝固成平板,將涂布棒的三角部分浸沒(méi)于酒精中,取出后再通過(guò)燈焰,點(diǎn)燃其上的乙醇,待涂布棒上的火焰熄滅后,將其觸碰無(wú)菌瓊脂平板的表面使其冷卻。然后,取少許菌液(100uL)滴在平板上,用涂布棒作圓周運(yùn)動(dòng)將菌液涂布均勻,待平板干后于37℃倒置培養(yǎng)。待菌落長(zhǎng)出后,觀察菌落特征
(二) 在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)
取5mL液體培養(yǎng)基加入一支無(wú)菌試管中,用無(wú)菌牙簽挑一個(gè)單菌落浸沒(méi)于培養(yǎng)液中并輕輕振動(dòng),使待接種的細(xì)菌分散在培養(yǎng)液中,蓋好試管,在搖床上以60r/min于37℃培養(yǎng)至飽和(約6h),觀察液體培養(yǎng)物是否混濁。利用分光光度計(jì)監(jiān)測(cè),按每0.1 OD值大約相當(dāng)于108細(xì)胞/mL計(jì)算細(xì)菌濃度。