(一)形態(tài)學鑒定

1．光學顯微鏡檢查

(1)培養(yǎng)瓶(皿)或培養(yǎng)板直接置于倒置顯微鏡下觀察，上皮細胞呈多邊形，邊界清晰，大小規(guī)則，核呈圓形，核質比例小，細胞間排列整齊，為單層培養(yǎng)物，無重疊生長，是正常上皮組織來源；成纖維細胞呈長梭形，核小而圓，細胞排列規(guī)則、整齊，為單層培養(yǎng)物，無重疊生長，是正常間質組織來源。腫瘤組織來源的貼壁細胞，其單層培養(yǎng)物呈多層重疊生長。

(2)細胞染色檢查：將無菌小玻片(O．5cm×2cm)于細胞傳代接種前放人培養(yǎng)瓶皿內，接種細胞懸液后培養(yǎng)，在玻片上制備培養(yǎng)的單層細胞，然后將載有細胞的玻片取出，用磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffeer saline，PBS)輕輕漂洗后，將玻片放在普通玻片上，空氣中自然干燥。經PBS／甲醇(1：1)固定液同定15min，棄固定液，加吉姆薩(Giemsa)染色液染色10～15min，用清水漂洗干凈，置于空氣中干燥，用二甲苯透明，用光學樹脂膠片封片后觀察。上皮細胞和成纖維細胞的形態(tài)與直接鏡檢相同，細胞核染成紫紅或藍紫色，胞質染成粉紅色。

2．電子顯微鏡觀察通常用透射電鏡檢查細胞的超微結構。取對數(shù)生長期的細胞，用胰蛋白酶消化，加培養(yǎng)液懸浮消化的細胞，用1000r／min離心5min。收集離心管底部細胞，經戊二醛固定，包埋，超薄切片；也可采用細胞原位包埋的方法，將細胞培養(yǎng)于電鏡用特殊膜上，進行固定，包埋，該法不破壞細胞問排列關系。在電鏡下可見到上皮細胞的張力原纖維和橋粒等，腺細胞可見胞質中的分泌顆粒，這對確定培養(yǎng)細胞系組織來源有重要意義。

(二)細胞核型分析

    細胞染色體核型分析能簡易、有效地確定細胞種來源和鑒定正常或惡性的性質，以及檢查細胞有無交叉污染等。細胞染色體核型分析包括制備中期細胞分裂象樣本，將分散的單個染色體進行計數(shù)和排列分組分析。

1．制備細胞分裂樣本取對數(shù)生長期的細胞懸液，加入1×1 0-5 mol／L秋水仙素(終濃度為1×10-7mol／L)到養(yǎng)液中，處理6h后，輕輕吸出培養(yǎng)液，加0．25％胰蛋白酶消化細胞或手振搖培養(yǎng)瓶使細胞脫落，收集中期分裂象細胞，37℃靜置20min后加入冰醋酸一甲醇(1：1)1ml，固定細胞1～20min，再次以1000r／min離心：10min，去上清液，加入新固定液，吹打混勻，第3次經1000r／mln離心10min，收集分裂象細胞。

2．制備染色體玻片將沉集的細胞加入O．2ml醋酸甲醇分散細胞，取一滴細胞懸液加到冰冷的玻片上，同時用口吹散細胞液滴，使細胞均勻分散于玻片上。同時可多制備幾張染色體玻片，待干燥后染色、鏡檢。

3．染色體計數(shù)及核型分析取染色體玻片經吉薩姆染色后鏡檢。在顯微鏡下可觀察到多個中期分裂象細胞染色體，計數(shù)50～100個細胞染色體數(shù)目，并計數(shù)出細胞染色體的分布，細胞群體中分布zui多的染色體數(shù)目是染色體數(shù)。人正常細胞有46條染色體，為23對二倍體。染色體分組排列，每組染色體無增加或減少，無異常染色體。小鼠染色體為40條，不僅數(shù)目與人染色體不同，而且以頂端著絲點為主。人的染色體則為中央著絲點，數(shù)目與著絲點位置可作為細胞系是人或鼠來源的依據(jù)。

(三)細胞DNA指紋技術檢測

    利用DNA指紋技術(DNA finger printing)檢測細胞基因多態(tài)性，對于判斷所建立的細胞系來源非常有用。細胞系的基因多態(tài)性應與其來源的個體基因相似，所以應保留原代組織或來源個體的血液作為對照樣品。

1．制備細胞DNA的雜交膜

(1)用胰蛋白酶消化培養(yǎng)細胞，將消化的細胞用．PBS洗2～3次，1000r／min離心5min，收集細胞，提取細胞DNA，用紫外分光測DNA含量。DNA經EcoRI酶切，37℃處理，并取少量樣品經瓊脂糖電泳，應看到有大于5kb的DNA條帶出現(xiàn)。

(2)將酶切處理的DNA加入6×上樣緩沖液混勻，上樣到分析膠上，同時應有其他已知細胞系的酶切DNA為對照，以及與分子量標準標志物一起電泳(3V／cm)，直到分子量際準HindⅢ酶切*片段(23kb)已泳動出一定距離(電泳17～20h)，在紫外燈下照相記錄。

(3)分析膠變性后進行Southern印跡雜交分析。將分析膠中的DNA電轉移至硝酸纖維膜上，取出膜暴露于紫外線(302nm)下5min，然后放人干燥的雜交袋中保存，待雜交。

2．制備標記M13噬菌體探針

(1)放射性同位素標記M13：DNA取稀釋的M13噬菌體2μl與1μ1無菌蒸餾水混合于離心管中，放人沸水中2min，再放冰上5min，然后加11．4μl的緩沖液和0．5μl牛血清白蛋白，加入10μl a一[32P]一dGTP、2μl Klenow酶，混合管中的內容物，短暫離心1次，放置溫室。

(2)純化M13 DNA探針：將放置的上述內容物吸出，加到已平衡好的葡聚糖(sephadex)柱內，上2×40μI過柱緩沖液，收集2次400μ1緩沖液的洗出液放人離心管內，作為探針。將放有探針的離心管放入沸水中2min，移至冰上冷卻，待雜交用。

3．DNA雜交用標記好的M13探針與細胞DNA進行Southern印跡雜交分析。首先將轉移膜放入預熱的預雜交液袋中，置55℃振搖4h，然后移到預熱的雜交液袋中，于55℃，同時加入探針進行雜交。次日將雜交后的轉移膜置洗液中室溫漂洗15min，共洗2次，再用預熱55％含有O．1％SDS的洗液沖洗，于55℃振搖15min。zui后用1×SSC液洗膜，置濾紙上自然晾干。用放射性檢測儀檢查膜上存在的放射性同位素，進行放射自顯影，沖洗x線膠片。

    自顯影膠片上顯示細胞DNA的電泳帶型和組織來源細胞DNA對照的帶型等，這對于鑒定細胞種的來源和組織來源提供了非常有用的證據(jù)，因為每個細胞系(除與組織來源的細胞)有*的帶型。

(四)同工酶檢查

    不同種系的細胞和同一種系不同組織之間同1二酶的表達呈多形性，酶功能雖相同，但結構各異，正常和腫瘤組織細胞之間的同工酶也不同，因此檢測同工酶對于鑒定細胞系很有價值，常用于檢測的同工酶有核苷酸磷酸酶(nucleoside phosphorylase)、葡萄糖6磷酸脫氫酶(glucose一6一phosphate dehydrogenase，G6PD)、蘋果酸脫氫酶(malate dehydrogenase，MD)、乳酸脫氫酶(1actate dehydrogenase，LD)。

    同工酶的鑒定應先收集細胞，分別提取標準細胞、對照細胞及檢測細胞的提取液，即*溶解上述細胞(細胞膜呈云霧狀)，離心取上清液。制備凝膠，上樣(細胞提取液)進行電泳，可用瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠兩種方法電泳。取下凝膠，同酶試劑反應，即針對不同酶加入相應的底物顯色，進行檢測。檢測細胞系的同工酶譜具有特異的帶型．與原取材組織相同，但與對照細胞、標準細胞比較，即可區(qū)分出人和鼠等種系的細胞來源。

(五)抗原標記

    細胞表面抗原可作為鑒定細胞來源的重要標志物，如上皮細胞表面特異性抗原可與正常上皮細胞熒光抗體結合，在熒光顯微鏡下可見細胞表面出現(xiàn)熒光，作為正常上皮細胞的標志。也可用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme—linked immunosorhent assay，ELISA)檢測。

(六)細胞生長實驗

    正常細胞的生長與腫瘤細胞、轉化細胞具有明顯差別。正常細胞移植到裸鼠體內無浸潤生長，不形成腫瘤；另外，在培養(yǎng)器皿中生長具有形成單層(具有接觸性抑制)、飽和密度及停泊依賴等特點。