人GFAP 免疫組化試劑盒
該試劑盒以HRP 標記的鏈霉親和素復合物(HRP Streptavidin Conjugate,HRP-SA)為基礎,可用于檢測細胞、組織內(nèi)的特異性GFAP 抗原。該試劑盒具有靈敏度高、特異性強、定性定位準確、背景清晰。在所用的GFAP 一抗與相應靶抗原結合后,用生物化二抗與一抗特異性結合,zui后加入HRP-SA,形成抗原—特異一抗—生物素化二抗—HRP-SA 復合物,顯微鏡下觀察成像。
試劑盒所含試劑:
試劑A 通透液:0.1% Triton-X 100 10 mL(選用)
試劑B 封閉緩沖液(封閉用) 20 mL
試劑C (*分裝)已稀釋的即用型GFAP 一抗(2.5ml)
試劑D (*分裝)生物素化羊抗兔IgG 1 支(濃度1.5 mg/mL,稀釋比為1:300~1:500)100 μL+抗體稀釋液20ml
試劑E HRP-SA 復合物1 支(濃度1 μM,稀釋比1:50~1:200)100 μL
試劑F DAB 顯色液5ml
用戶自備試劑:
1. 10mM TBS(pH7.2~7.4)三羥基氨基甲烷1.21g氯化鈉7.6g加蒸餾水800mL,濃鹽酸調(diào)pH 值至7.2~7.4,zui后定容至1000mLTBS-T:TBS+Tween 20(0.05%體積比)
2.抗原修復液(依檢測抗原不同而選擇不同的修復液)10mM pH6.0 檸檬酸緩沖液檸檬酸0.38g檸檬酸三鈉2.45g加蒸餾水900mL,濃鹽酸調(diào)pH 值至6.0,zui后定容至1000mL或:0.5M EDTA 修復液(pH8.0)EDTA·2H2O 186.1g檸檬酸三鈉2.45g加蒸餾水700mL,用10mM NaOH 調(diào)pH 值至8.0,zui后定容至1000Ml
3. 緩沖甘油封固劑10 mL
4. Tween 20 5 mL
石蠟包埋組織切片免疫染色
實驗步驟(建議方案):
石蠟包埋組織切片3~4μm 厚度
1.烤片: 將待做切片置于切片架上,于60℃恒溫烤箱中至少烤1 hr;
2.脫蠟: 切片放入盛有二甲苯的容器中脫蠟3 次(即二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ),每次10 min;
3.水化: 切片經(jīng)下行酒精水化,無水乙醇5min,95%乙醇2 次(每次2min),85%乙醇2 min;75%乙醇2min,自來水沖洗,ddH2O 洗2×2min;
4.抗原修復: 根據(jù)抗體說明書推薦方法進行抗原修復,常采用高壓、微波(溫度達到98~100℃)或酶消化修復法,室溫自然冷卻,自來水沖洗,ddH2O 洗2×
2min,TBS 洗滌(2×2min)(具體修復方法見附1)* 注:有些抗原勿需修復,直接進入第5 步封閉。
5.封閉: 滴加試劑B,37℃濕盒孵育30 min;
6.加一抗:滴加用試劑C(即用型一抗),37℃濕盒孵育2 hr 或4℃;
7.洗滌: TBS-T 洗滌(3×5 min);
8.封閉: 滴加試劑B,37℃濕盒孵育10 min;
9.加二抗: 滴加用抗體稀釋液稀釋的生物素化二抗(試劑D),37℃濕盒中孵育30 min;
10.洗滌: TBS-T 洗滌(3×5 min);
11.封閉: 滴加試劑Tween 20,37℃濕盒孵育封閉20 min;
12.加HRP-SA: 滴加用試劑C 稀釋的試劑E(1:50~200,終濃度5~20 nM),37℃濕盒中孵育30 min;
13.洗滌: TBS-T 洗滌(3×5 min),TBS 洗滌(2×5 min);
14.顯色:應用DAB 溶液(試劑F)顯色;
15.復染:自來水充分沖洗,復染,脫水,透明;
16.封片: 待組織標本干后,用試劑緩沖甘油封固劑封片;
17.觀察成像: 顯微鏡下觀察成像。抗原
注意事項:
1. 修復后緩沖液須自然冷卻,自來水沖洗后方能把切片取出,驟冷有可能導致結晶或抗原封閉。
2. 緩沖液的量必須保證所有切片都能浸泡到,用過的檸檬酸緩沖液不能反復使用。
3. 若試劑為微量濃縮液,用前應低速離心,將內(nèi)蓋和管壁附著的溶液離到底部。
4. 封片前一定要換用TBS 充分洗滌,以便洗去組織上殘留的Tween 20,否則會影響結果觀察。
5. 如須復染細胞核,則在封片前復染或直接采用含有染核試劑的封片劑進行封片。