雙抗體夾心法檢測抗原

    雙抗體夾心法用于檢測抗原。它是利用待測抗原上的兩個抗原決定簇A和B分別與固相載體上的抗體A和酶標(biāo)記抗體B結(jié)合，形成抗體A-待測抗原-酶標(biāo)抗體B復(fù)合物，復(fù)合物的形成量與待測抗原含量成正比。

實驗步驟

1．用包被液稀釋包被抗體至合適濃度，包被酶聯(lián)板，每孔100μL。也可37℃，2小時包被，但此方法不建議使用。包被抗體即可以是單抗，也可以是多抗。但抗體的包被濃度應(yīng)當(dāng)通過預(yù)實驗確定。包被的板條可以在4℃保存數(shù)月。

2．每孔加入100ul洗滌緩沖液，清洗酶聯(lián)板3-5次。

3．10%小牛血清封閉，每孔200μL，濕盒中37℃封閉1小時。也可以用1.5%酪蛋白或者0.25%的BSA封閉。

4．每孔加入100ul洗滌緩沖液，清洗酶聯(lián)板3-5次。zui后一次在吸水紙上扣干。

5．加標(biāo)準(zhǔn)樣品及樣本。

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線：用1×PBS稀釋標(biāo)準(zhǔn)品分別至1000ng/ml、500ng/ml、250 ng/ml、125 ng/ml、62.5 ng/ml、31.25 ng/ml、15.625 ng/ml、7.18 ng/ml。

（2）待測樣品：用1×PBS稀釋（不同樣品的稀釋倍數(shù)不同，一般稀釋原則為稀釋后的樣品濃度應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線之內(nèi)）。

（3）以上下做平行孔，前兩孔作空白加入1×PBS，其余依次加入標(biāo)準(zhǔn)曲線、待測樣品。加入體積每孔100ul。濕盒中37℃反應(yīng)1小時。

抗原抗體反應(yīng)比較快，一般1~2小時就達(dá)到峰值。延長反應(yīng)時間容易出現(xiàn)非特異結(jié)合。

6．每孔加入100ul洗滌緩沖液，清洗酶聯(lián)板3-5次。zui后一次在吸水紙上扣干。

7．加酶標(biāo)二抗，根據(jù)抗體使用說明用1×PBS稀釋，每孔100ul濕盒中室溫反應(yīng)40分鐘。

二抗的使用濃度應(yīng)當(dāng)進(jìn)行預(yù)實驗確定，二抗的反應(yīng)時間不能過長，容易出現(xiàn)非特異反應(yīng)。

8．每孔加入100ul洗滌緩沖液，清洗酶聯(lián)板3-5次。zui后一次在吸水紙上扣干。

9．加底物顯色液：稱取OPD（鄰苯二胺）4mg用10ml底物緩沖液充分溶解，加入15ul H202每孔100ul閉光反應(yīng)5分鐘。OPD要充分溶解，否則容易出現(xiàn)個別孔顏色太深。

10．終止液終止反應(yīng)每孔100ul終止液。

11．酶聯(lián)免疫檢測儀492nm讀數(shù)。

12．以測定的OD值繪制線性回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線，以標(biāo)準(zhǔn)品蛋白濃度LN值為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的OD值為縱坐標(biāo)，繪制出一條標(biāo)準(zhǔn)曲線并添加線性回歸趨勢線，其相關(guān)系數(shù)R2應(yīng)大于0.95，根據(jù)方程計算出樣品中的目標(biāo)蛋白含量。抗體