蛋白質的分離純化方法
沉淀法:原理:是使蛋白質膠體顆粒的表面水化膜或表面電荷破壞,從而使蛋白質沉淀。
• 鹽析法
• 有機溶劑沉淀法
• 等點電沉淀法
• 選擇性變性沉淀法
• 聚合物沉淀法
在生物大分子制備中zui常用的幾種沉淀方法是:
• 中性鹽沉淀(鹽析法):zui大的特點是環(huán)境溫和,不易造成蛋白質變性。因此適用于各種蛋白質和酶的分離純化。缺點是分辨率底,且后續(xù)處理時需要除鹽。
• 有機溶劑沉淀:分辨率高于鹽析法,但容易引起目的蛋白失活。所以多用于生物小分子的分離純化比如多肽、寡肽。
• 等電點沉淀:其局限是,須事先了解蛋白的PI;且沉淀過程中可能發(fā)生變性和失活,部分蛋白等電點沉淀后不容易溶解,因此較少用于目的蛋白的沉淀。用于氨基酸、蛋白質及其他兩性物質的沉淀,但此法單獨應用較少,多與其他方法結合使用。
• 選擇性沉淀(熱變性沉淀和酸堿變性沉淀):多用于除去某些不耐熱的和在一定pH值下易變性的雜蛋白。三氯yi醚是比較常用的酸變性劑,尤其在分析樣品的濃縮而不需考慮活性的條件下用得多。
• 有機聚合物沉淀:是發(fā)展較快的一種新方法, 主要使用PEG聚乙二醇作為沉淀劑,常用PEG6000和20000。它條件溫和,不易變性,且沉淀效果強,很少量的PEG可沉淀大量的蛋白。缺點是PEG除去比較困難。
根據(jù)分子大小不同:超濾法、透析法(膜分離法)、超速離心法、 凝膠過濾法(GF)也稱大小排阻層析,是一種根據(jù)分子的大小和形狀來進行分離的方法。不同的蛋白質分子通過凝膠微孔時因遷移能力不同而被分離。利用有一定孔徑范圍的多孔凝膠作為固定相,(在其分離范圍內)按分子大小將樣品中各組份分離開來。大分子先被洗脫,小分子后被洗脫。應用:脫鹽 Sephadex G10、25,中間純化 Sephadex G200,精純 Sephacryl 、Superdex。常用填料:Sephadex系:是以氯代環(huán)氧丙烷進行交聯(lián)的葡聚糖珠狀凝膠,經(jīng)典的凝膠介質。Sepharose系:經(jīng)過純化的瓊脂糖,含極少的帶電集團。型號zui多、應用zui廣。Sephacryl系:有是丙基葡聚糖與N,N’-亞甲基雙丙稀酰胺共聚而成,經(jīng)濟。Superdex系:是葡聚糖與瓊脂糖共聚而成的復合凝膠,,選擇性強,分辨率*。
• 凝膠類型:葡聚糖凝膠(Sephadex)和瓊脂糖凝膠(Sepharose)。
• 葡聚糖凝膠:直鏈的葡聚糖分子和交聯(lián)劑3—氯1,2—環(huán)氧丙烷交聯(lián)而成。
凝膠回收處理方法:將樣品*洗脫下來后,繼續(xù)用三倍柱床體積的洗脫液沖洗凝膠后,將柱下口放在小燒杯中,慢慢打開,再將上口慢慢松開,使凝膠全部回收至小燒杯中,備用。
G類葡聚糖凝膠常用G-X代表,X數(shù)字既代表交聯(lián)度,也代表特水量。X數(shù)字越小,交聯(lián)度越大,網(wǎng)孔越小,適用于分離低分子質量生化產品。X數(shù)字越大,交聯(lián)度越小,網(wǎng)孔越大,適用于分離高分子生化產品。X數(shù)字也代表凝膠的持水量,如G-25表示1g干膠持水2.5mL,G-100表示 1g干膠持水10mL,依次類推。葡聚糖凝膠和生物膠多以干粉形式保存,使用前需用水或洗脫緩沖液充分溶賬。在室溫下讓其充分溶賬脹達到平衡,通常需要較長時間。較快的做法是將干膠往水里加,邊加邊攪,以防凝膠結塊,然后放到沸水浴中加熱接近100℃,幾個小時就可以使其溶脹,還可起到除去顆粒內部氣泡和殺菌作用。新柱裝好后,要用洗脫緩沖液平衡,一般用3~5倍體積的緩沖液在恒壓下流過柱床。新裝好的柱要檢驗其均勻性-可用帶色的高分子物質如藍色葡聚糖-2000配成2mg/mL的溶液過柱,觀察色帶是否均勻下降。也可以對光檢查,看其是否均勻或有無氣泡存在。
蛋白質的分離純化方法
凝膠用過后,有幾種保存方法:
濕態(tài)保存:在水相中加防腐劑,或水洗到中性,高壓滅菌封存(或低溫存放);
濕態(tài)保存:在水相中加防腐劑,或水洗到中性,高壓滅菌封存(或低溫存放);
干燥保存:水洗后濾干,依次用50%、70%、90%、95%乙醇脫水,再用乙醚洗去乙醇,干燥(或60~80℃烘干)后保存。加乙醇時,切忌一上來就用濃乙醇處理,以防結塊
對生物樣品來說,經(jīng)常遇到的是兩種分離形式。一種是只將分子量極為懸殊的兩類物質分開,如蛋白質與鹽類,稱作類分離或組分離。例如從蛋白質溶液中除去無機鹽。我們知道,蛋白質的分子量都大于5000D,而無機鹽的分子量一般在幾十到幾百之間。所以常選用Sephadex G-25凝膠作為分離固定相,因為它的分離范圍是1000~5000D。被分離的兩組物質的分子量正好落在分離范圍的兩側。大分子組為全排阻,而小分子組為全滲入,其Kd值的差可達zui大值1。對于分子量小于5000D的肽類進行脫鹽操作則常選用Sephadex G-15凝膠。
另一類則是要將分子量相差不很大的大分子物質加以分離,如分離血清球蛋白與白蛋白,這叫做分級分離。后者對實驗條件和操作要求都比較高。下面以zui常用的葡聚糖凝膠類為例,分別加以討論 。
葡聚糖凝膠離子交換劑使用方法
新購進的陽離子交換劑(如CM-Sephadex C-25)為Na型,陰離子凝膠交換劑(如DEAE-Sephadex A-25)為Cl-型,使用前要按一般離子交換劑的使用方法進行轉型處理。1g陰離子交換劑約用100mL,0.5mo1/L NaoH溶液浸泡20min后減壓過濾,充分洗滌,再用等量0.5mol/L HCL處理,洗至中和備用。陽離子交換劑lg約用100mL 0.5mol/L HCL浸泡20min后過濾,充分洗滌,再用等量0.5mo1/L NaOH溶液處理20min,洗至中性備用。將以上處理好的葡聚糖凝膠離子交換劑,用20~30倍量與層析時所用的同種緩沖液浸泡(但濃度要高,如0.1~0.5mol/L),再用同種酸或堿調節(jié)至所需要pH值,放置1h后,待pH值不變即可減壓過濾。
型號 | 分離范圍Da | 粒徑 | 建議流速cm/h |
Sepharose 2B | 70-40,000 | 60-200 | 10 |
Sepharose 4B | 60-20,000 | 45-165 | 11.5 |
Sepharose 6B | 10-40,000 | 45-165 | 14 |
Sepharose CL-2B | 70-40,000 | 25-75 | 15 |
Sepharose CL-4B | 60-20,000 | 25-75 | 26 |
Sepharose CL-6B | 10-40,000 | 25-75 | 30 |
Sepharose 6 | 5-5,000 | 20-40 | 30 |
Sepharose 12 | 1-300 | 20-40 | 30 |
Sepharose FF 6 | 10-4,000 | 平均90 | 300 |
Sepharose FF 4 | 60-20,000 | 平均90 | 250 |
• 根據(jù)分子所帶電荷差異電泳法、等電聚焦等。離子交換層析法(IEX):原理:首先是根據(jù)蛋白質的帶電類型(陽離子或陰離子),然后根據(jù)其相對電荷強度進行分離。PH:陰離子交換層析:蛋白質帶負電荷,則要求PH>PI,但不能高于介質功能基團的PK;陽離子交換層析:蛋白質帶正電荷,則要求PH<PI,但不能低于介質功能基團的PK;緩沖溶液:陰離子交換層析:Tris-HCl 陽離子交換層析:PB。帶電荷量少,親和力小的先被洗脫下來,帶電荷量多,親和力大的后被洗脫下來。陽離子交換劑 — 帶負電荷,與陽離子交換;陰離子交換劑 — 帶正電荷,與陰離子交換。
常見問題分析:
不吸附:緩沖溶液PH不對;離子強度太高;
峰形不穩(wěn)或出現(xiàn)奇異峰:柱床中有氣泡或緩沖溶液不純
分辨率低:梯度太大;流速太高
前沿峰:柱過載;填充效果差;柱需再生
峰拖尾:樣品在柱濾膜上或凝膠床頂部沉淀
基線隨梯度上移:鹽濃度臨近CMC
1.離子交換樹脂
2.離子交換纖維素
§ 陰離子交換纖維素 —如:DEAE-纖維素 pH8.6以下分離中性或酸性物質,具二乙胺乙基
§ 陽離子交換纖維素—如:CM-纖維素 一般pH>4條件下使用,具有羧甲基
3.離子交換凝膠— 分離大分子物質
離子交換劑的選擇考慮因素:
1.被分離物質帶何種電荷
2.被分離物質分子的大小
大分子物質選用凝膠,其次選用纖維素
3.被分離物質所處的環(huán)境
4.被分離物質的物理化學性質
5.被分離物質的大概數(shù)量
根據(jù)疏水性不同:疏水層析(HIC)、反相色譜(RPC): 原理:是指固定相的極性低于流動相的極性,在這種層析過程中,極性大的分子比極性小的分子遷移速度快而先被洗脫下來。一般使用甲醇、乙腈作流動相,使得蛋白質容易變性失活;常用于HPLC分析,與在水-有機相中穩(wěn)定的多肽和低分子量蛋白質的分離。
蛋白質的分離純化方法
梯度淋洗裝置
外梯度:利用兩臺高壓輸液泵,將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室,混合后進入色譜柱。
內梯度:一臺高壓泵, 通過比例調節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。
示差折光檢測器:可連續(xù)檢測參比池和樣品池中流動相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比;可連續(xù)檢測參比池和樣品池中流動相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比;
親和層析(AC):
色譜技術