抗酶抗體的優(yōu)點,在于酶和抗體結合時,不需要通過化學交聯(lián)劑交聯(lián),抗體的失活少。在酶復合物形成后,同時就具有酶的活性,遇到相應的底物即呈現(xiàn)催化顯色作用。必須注意,抗酶抗體必須用與*抗體同種來源的動物制備。
(一)抗酶抗體的制備
于家兔的兩個后足掌內各注入弗氏*佐劑(含活卡介苗12mg/ml)和過氧化物(5mg/ml)
的等量混合乳化液0.5ml,兩星期后,于兩側腘淋巴結內注入同樣液體。一周后靜脈注射0.2ml~0.4ml,過氧化物酶液(同樣濃度), 并同樣強化2-3次,末次注射后一周驗血、分離血清即為過氧化物酶抗體。
(二)酶-抗酶復合物(PAP)的制備
1.取單價特異性抗酶血清10ml,1.5×104r/min(4℃)離心20min,吸取上清。
2.于上清液中滴加酶溶液(0.5mg/ml)直至不再產(chǎn)生沉淀,靜置1h,1.5×104r/min離心20min。
3.將沉淀物用冷生理鹽水125ml洗三次,每次1.5×104r/min離心20min。
4.于冰浴下,將沉淀物懸混于4ml HRP(2mg/ml)中。
5.在pH計監(jiān)測下,邊攪拌邊加0.1Mol/L或0.01Mol/L HCl至pH 2.3。此時沉淀已全部溶解,1.5×104r/min離心20min。
6.吸取上清,用0.1Mol/L NaOH調pH至7.4。
7.量體積,加入1/10容量的0.075Mol/L醋酸鈉和0.15Mol/L醋酸銨的等量混合液。
8.逐滴加入等體積的100%飽和硫 酸銨,攪拌20min。1.5×104r/min離心20min。
9.將沉淀物用50%飽和硫 酸銨洗1次,同樣離心。
10.將沉淀物懸混于5ml蒸餾水中,以pH6.75緩沖鹽水透析3天,每天換水1次。(緩沖鹽水由1.35×104ml生理鹽水, 25ml 1.5Mol/L醋酸鈉和75ml 2Mol/L醋酸銨配成)。
11.1.5×104r/min(4℃)離心20min,吸取上清,于OD280nm和OD403nm測定,計算IgG和酶含量及克分子比值。
12.按0.1ml分裝,-20℃保存。
13.應用時從低溫冰箱中取出,立即在37℃水浴中融化