培養(yǎng)基的制備
目的要求:
1.掌握一般培養(yǎng)基制備的原則和要求。
2.熟悉一般培養(yǎng)基制備的過程。
操作步驟:
一、培養(yǎng)基的制備原則和要求
培養(yǎng)基是根據各類微生物生長繁殖的需要,用人工方法把多種物質混合而成的營養(yǎng)物。一般用來分離、培養(yǎng)菌類。常用的培養(yǎng)基有基礎培養(yǎng)基、增菌培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基和厭氧培養(yǎng)基。在制備培養(yǎng)基時,應掌握如下原則和要求:
(一)培養(yǎng)基必須含有細菌生長繁殖所需要的營養(yǎng)物質。所用的化學藥品必須純凈,稱取的份量務必準確。
(二)培養(yǎng)基的酸堿度應符合細菌生長要求。按各種培養(yǎng)基要求準確測定調節(jié)pH值。多數細菌生長的適宜pH值為7.2~7.6,呈弱堿性。
(三)培養(yǎng)基的滅菌時間和溫度,應按照各種培養(yǎng)基的規(guī)定進行,以保證滅菌效果及不損失培養(yǎng)基的必需營養(yǎng)成分。培養(yǎng)基經滅菌后,必須置37℃溫箱中培養(yǎng)24小時,無菌生長者方可應用。
(四)所用器皿須潔凈,忌用鐵或鋼質器皿,要求沒有抑制細菌生長的物質存在。
(五)制成的培養(yǎng)基應該是透明的,以便觀察細菌生長性狀以及其他代謝活動所產生的變化。
二、培養(yǎng)基制備過程
不同的培養(yǎng)基其制備方法也不同,一般包括以下步驟:
(一)準確稱量試劑 根據不同的菌類和用途,選擇適宜的培養(yǎng)基,培養(yǎng)基所需試劑必須純凈。
(二)校正pH值 將稱量好的培養(yǎng)基各種成分放入容器內,標記劃線,加熱溶解,補充水分,測定酸堿度,常用pH6.8~8.0的精密試紙或酸度計測定。用1N
NaOH和1N HCl調節(jié)pH值到適宜范圍內。
(三)過濾 將玻璃漏斗置鐵架上,再用紗布夾棉花或用濾紙放在漏斗中,將上述培養(yǎng)基倒入其中過濾至透明。
(四)分裝 將過濾后的培養(yǎng)基分裝于中試管或三角瓶內(試管內每支裝5mL;三角瓶中裝100~150ml),塞好棉塞用牛皮紙包扎好,準備滅菌。
(五)滅菌
培養(yǎng)基的滅菌,常用高壓蒸汽滅菌法。一般微生物的營養(yǎng)細胞在水中煮沸后即被殺死,但細菌的芽胞有較強的抗熱性,須經高壓蒸汽滅菌才能達到*滅菌的目的。根據蒸汽溫度隨壓力升高而上升的原理,即壓力越大,蒸汽溫度就越高。因此,在同一溫度條件下,采用高壓蒸汽滅菌比干熱滅菌法效果要好。而且在濕熱情況下,菌體吸收水分后,其蛋白質易于凝固變性,因為蒸汽的穿透力強,殺菌效果好。
高壓蒸汽滅菌,一般采用15磅/平方(即1.05kg/cm2)壓力,此時的溫度是121.3℃。滅菌20~30分鐘后,可達到*滅菌的目的。在進行滅菌的時候,首先要把滅菌鍋內的冷空氣排出,否則,冷空氣存在會降低鍋內的實際溫度,影響滅菌效果。
三、基礎培養(yǎng)基的制備
(一)牛肉浸液(肉水)
1.成分 新鮮牛肉 500g ,水1000 ml。
2.制法
(1)取新鮮牛肉,剔除肌膜、脂肪,切成小塊,用絞肉機絞碎。
(2)按上述比例加水,浸泡過夜(夏天應將浸泡液放置在低溫的地方,防止腐?。蝗绻麤]有冷藏條件時,可省去浸泡過夜這一步),其間應攪拌數次。
(3)次日取上液煮沸一小時,并不斷攪拌。
(4)補足蒸發(fā)的水分,用白布或絨布過濾后分裝于三角瓶中,準備滅菌。
(5)置高壓滅菌器內,15磅滅菌20~30分鐘,置低溫、暗處保存?zhèn)溆谩?
3.用途
用于制備各種培養(yǎng)基的基礎液。
(二)肉浸液肉湯(普通肉湯)
1.成分 肉水 1000 ml ,蛋白胨 10g,氯化鈉 5g,磷酸氫二鉀 2g。
2.制法
(1)將以上成份加溫溶于牛肉浸液中。
(2)調pH值為7.4~7.6。
(3)濾紙過濾后分裝。
(4)15磅20~30分鐘滅菌后備用。
3.用途 作一般細菌培養(yǎng)用。
(三)營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(普通瓊脂)
1.成分 肉水 1000ml,蛋白胨10g,磷酸氫二鉀 lg ,氯化鈉 5g,瓊脂 20g。
2.制法
(1)將上述成分混合后,加熱溶解,補足水份。
(2)校正pH值7.4~7.6。
(3)用紗布夾棉花過濾。
(4)分裝于中試管或三角瓶中。
(5)高壓滅菌20~30分鐘后,將中試管擺成斜面,保存?zhèn)溆谩?
3.用途 一般細菌分離培養(yǎng)、菌種保存或用作特殊培養(yǎng)基。
(四)半固體培養(yǎng)基 基本上與營養(yǎng)瓊脂的制備相同,僅將瓊脂量減少至0.5~0.7%(1000 ml中加5~7g瓊脂)即可。
(五)鮮血瓊脂
將滅菌的營養(yǎng)瓊脂加熱溶化,冷卻至45~50℃時,加入5~8%無菌脫纖鮮血(綿羊、黃 牛、馬和兔等),分裝于試管后立即擺成斜面、或傾注于平皿中,待凝固后,置37℃培養(yǎng)1~2日。有污染者廢棄;無菌者保存,置冰箱備用。
無菌脫纖維鮮血的制備:以無菌操作采取動物鮮血(綿羊、黃 牛、馬從頸靜脈采血;兔則從心臟采血),放入帶玻璃珠的無菌三角瓶內,搖動5~10分鐘,放冰箱中備用。