小鼠三碘甲狀腺原氨酸(T3)酶聯(lián)免疫分析
試劑盒使用說(shuō)明書(shū)
本試劑盒僅供研究使用。
檢測(cè)范圍:96T
1pmol/L - 32pmol/L
使用目的:
本試劑盒用于測(cè)定小鼠血清、血漿及相關(guān)液體樣本中三碘甲狀腺原氨酸(T3)含量。
實(shí)驗(yàn)原理:
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中小鼠三碘甲狀腺原氨酸(T3)水平。用純化的小鼠三碘甲狀腺原氨酸(T3)抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入三碘甲狀腺原氨酸(T3),再與HRP 標(biāo)記的三碘甲狀腺原氨酸(T3)抗體結(jié)合,形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物,經(jīng)過(guò)*洗滌后加底物TMB 顯色。TMB 在HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的三碘甲狀腺原氨酸(T3)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD 值),通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中小鼠三碘甲狀腺
原氨酸(T3)濃度。
試劑盒組成:
1、30倍濃縮洗滌液20ml×1瓶7終止液6ml×1瓶
2、酶標(biāo)試劑6ml×1瓶8標(biāo)準(zhǔn)品(64pmol/L)0.5ml×1瓶
3、酶標(biāo)包被板12孔×8條9標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1.5ml×1瓶
4、樣品稀釋液6ml×1瓶10說(shuō)明書(shū)1份
5、顯色劑A液6ml×1瓶11封板膜2張
6、顯色劑B液6ml×1瓶12密封袋1個(gè)
標(biāo)本要求:
1、標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取,提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行,提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn),可將標(biāo)本放于-20℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融
2、不能檢測(cè)含NaN3 的樣品,因NaN3 抑制辣根過(guò)氧化物酶的(HRP)活性。
操作步驟:
1、標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋:本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支,用戶可按照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀釋。
32pmol/L5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150μl的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
16pmol/L4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150μl的5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
8pmol/L3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150μl的4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
4pmol/L2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150μl的3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
2pmol/L1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150μl的2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
2、加樣:分別設(shè)空白孔(空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,其余各步操作相同)、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50μl,待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,然后再加待測(cè)樣品10μl(樣品zui終稀釋度為5 倍)。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動(dòng)混勻。
3、溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30 分鐘。
4、配液:將30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水30 倍稀釋后備用
5、洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30 秒后棄去,如此重復(fù)5 次,拍干。
6、加酶:每孔加入酶標(biāo)試劑50μl,空白孔除外。
7、溫育:操作同3。
8、洗滌:操作同5。
9、顯色:每孔先加入顯色劑A50μl,再加入顯色劑B50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色15 分鐘.
10、終止:每孔加終止液50μl,終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。
11、測(cè)定:以空白空調(diào)零,450nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(OD 值)。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15 分鐘以內(nèi)進(jìn)行。
操作程序總結(jié):
計(jì)算:
以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo),在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)樣品的OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度;再乘以稀釋倍數(shù);或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD 值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式,將樣品的OD 值代入方程式,計(jì)算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實(shí)際濃度。
注意事項(xiàng):
1、試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30 分鐘后方可使用,酶標(biāo)包被板開(kāi)封后如未用完,板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
2、濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出,稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶,洗滌時(shí)不影響結(jié)果。
3、各步加樣均應(yīng)使用加樣器,并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性,以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間控制在5 分鐘內(nèi),如標(biāo)本數(shù)量多,推薦使用排槍加樣。
4、請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高(樣本OD 值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔*孔的OD 值),請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)(n 倍)后再測(cè)定,計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以總稀釋倍數(shù)(×n×5)。
5、封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。
6、底物請(qǐng)避光保存。
7、嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行,試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).
8、所有樣品,洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。
9、本試劑不同批號(hào)組分不得混用。
10、如與英文說(shuō)明書(shū)有異,以英文說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)。
保存條件及有效期:
1、試劑盒保存:2-8℃。
2、有效期:6 個(gè)月